Enzymy
restrykcyjne (restryktazy)-
endonukleazy bakteryjne.
Hydroliza
DNA przy ich użyciu to pkt wyjścia do innych technik IG.
Powstałe
frakcje DNA to substraty dla dalszych analiz, mają identyczne
zakończenia (nie są losowe).
Rozpoznają
tzw sekwencje palindromowe w większości odmienne.
Wyjątki:
izoschizomery.
- Pierwsza litera - rodzaj bakterii
- Druga i trzecia - gatunek
- Następna - szczep lub typ
- Kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują cyfry rzymskie (np. EcoRI, EcoRII, EcoRV)
Jednostka
enzymu- to jego
ilość, która kompletnie hydrolizuje 1µg DNA faga λ (około 50kb)
w czasie 1h w temp 37ºC. Istotne proporcje DNA: enzym w ustalaniu
parametrów reakcji enzymatycznej (star activity)!!! Np. nadmiar
enzymu może powodować, że pojawiają się dodatkowe aktywności
oprócz tych, które są przypisane danemu enzymowi. Poza fragmentami
określonymi, mogą się pojawiać jakieś dodatkowe.
Izoschizomery
Istnieją
enzymy takie które je posiadają i takie, które nie posiadają.
Izolowane
z różnych organizmów, rozpoznają takie same motywy sekwencyjne
(np. niektóre pary I. różnią się wrażliwością na metylację
C, A np. HpaII-Msp czy MboI-Sau3A)
Niekiedy
enzymy generują identyczne wystające końce (kompatybilne), mimo
rozpoznawania różnych sekwencji DNA (np. BamHI- G/GATCC i MboI-
/GATC)
Restryktazy
rozpoznające bardziej złożone motywy (8 nukleotydów) np. AsiSI,
AscI, SwaI, SbfI wykorzystywane w analizach całkowitych, genomowych
DNA, gł pozyskiwanych z org Eucaryota
Ważne
jest, aby wiedzieć czy dany enzym generuje tępe, czy lepkie końce:
Tępe
końce (płaskie)- 2
nici cięte w sposób symetryczny
Wystające
końce (lepkie)- brak
symetrii cięcia w komplementarnych niciach
Nie
zawsze sekwencja rozpoznawana przez enzym jest precyzyjnie określona
co do 1 nukleotydu
Enzymy
rzadko tnące-
generują mniej fragmentów
Rozpoznawane
4 nukleotydy- smuga spowodowana nakładaniem się na siebie dużej
ilości fragmentów
6
nukleotydów- wyżej
8
nukleotydów- jeszcze wyżej
Enzymy
restrykcyjne stwarzają możliwość konstrukcji map fizycznych DNA
(hydroliza wieloma enzymami), na podstawie analizy rozdziału
elektroforetycznego produktów reakcji hydrolizy
Użyteczne
w diagnostyce molekularnej m.in. dzięki nim wykrywane są mutacje
odpowiedzialne za występowanie chorób (Southern, RFLP).
EcoRI-
charakterystyka enzymu:
- Źródło: E.coli
- Wrażliwość na metylację: metylacja dam i dcm brak wrażliwości, sekwencja rozpoznawana przez ten ezn nie jest metylowana
- Inaktywacja enzymu: 65ºC przez 20min
- Ligacja
Przygotowanie
i łączenie fragmentów DNA
1)
Tworzenie i łączenie lepkich (wystających) końców z
wykorzystaniem jednego enzymu (DNA z dwóch różnych źródeł)
Inaktywacja
DNA (po inaktywacji restryktaz!!!)
2)
Hydroliza różnymi restryktazami, tworzenie komplementarnych końców
(lepkich) i ich łączenie (na przykładzie BamHI, BglII, BclI,
Sau3A). Dna z jednego lub innych źródeł.
Ligaza
DNA
3)
Formowanie tępych (płaskich) końców przez wypełnianie lepkich
końców powstałych po hydrolizie enzymami, które nie tworzą
końców wobec siebie komplementarnych (np. HindIII, EcoRI, BamHI).
Polimeraza
DNA, dNTP, ligaza DNA + ATP (po inaktywacji restryktaz)
4)
Tworzenie i łączenie płaskich końców w wykorzystaniem różnych
restryktaz (np. HaeIII, SmaI, AluI)
Ligaza
DNA + ATP (duży nakład)
5)
Tworzenie komplementarnych lepkich końców poprzez częściowe
wypełnianie końców
SalI
Polimeraza,
dTTP, DTP
Bam
HI
Polimeraza,
dATP, Stp.
Ligaza
DNA
6)
Łączenie lepkich końców za pomocą syntetycznych adapterów
EcoRI
Adapter
BamHI
Ligaza
DNA
Istnieje
możliwość wprowadzania pożądanych miejsc restrykcyjnych do
początku i końca sekwencji kodujących genu, co pozwala w kolejnych
etapie na ściśle określoną inercję genu w odpowiednio
przygotowany wektor.
Do
inaktywacji zamiast 65ºC wykorzystuje się czasem fenol
Efektywność
hydrolizy DNA
Szybkość
i kompletność hydrolizy związana jest z:
- Czystością preparatu
- Poziomem jego metylacji (hamuje reakcję)
- Doborem warunków trawienia (bufor, proporcje DNA: enzym)
Liczne
szczepy, z których izoluje się plazmidy zawierają specyficzne
metylazy (dam- metyluje A w obszarze GATC i dcm metyluje wewnętrzną
C w CC(A/T)GG).
Inhibują
one działanie licznych enzymów.
Plazmidowy
DNA izolowany z takich szczepów może być oporny na hydrolizę.
Lepiej
transformować, a później izolować plazmidy ze szczepów dam- czy
dcm-.
Eukariotyczne DNA zawiera pewien % 5mC (szczególnie u roślin, istotne różnice na poziomie tkanek).
Eukariotyczne DNA zawiera pewien % 5mC (szczególnie u roślin, istotne różnice na poziomie tkanek).
Ilość
DNA przeznaczona do analiz restrykcyjnych 0,2-2µg dla Prokaryota i
5-10µg dla Eukaryota.
W
I przypadku w wyniku hydrolizy powstają nieliczne, zdefiniowane
fragmenty.
W
II- charakterystyczne smugi DNA z pasmami frakcji repetytywnych na
ich tle (po elektroforezie)
Alternatywne
(mechaniczne) metody fragmentacji DNA
Shearing
przy użyciu strzykawki z igłą.
Stopień
fragmentacji zależy od grubości igły i ilości przypuszczeń.
Uzyskuje
się fragmenty zakończone tępo (nici DNA pękają zwykle
naprzeciwko siebie).
Różnorodność
powstałych fragmentów jest bardzo duża, pęknięcie może nastąpić
w dowolnym mscu.
Sonikacja-
preparat DNA poddawany działaniu ultradźwięków. Powodują one
pękanie nici. Odpowiedni stopień fragmentacji można uzyskać
dobierając eksperymentalnie warunki sonikacji (czas, natężenie
impulsu, liczba impulsów).
Podstawowe
enzymy w technikach IG- modyfikujące DNA/RNA:
1)
Odwrotna transkryptaza- polimerazy DNA zależne od RNA.
Synteza
nici DNA komplementarnej do matrycy RNA w kierunku 5’-3’,
wymagają startera z wolną gr 3’-OH i dNTP, zaleznie od rodzaju,
opt działania w 37-50
2)
Terminalna transferaza- dodaje kilka nukleotydów do końca 3’
DNA/RNA
3)
DNA polimeraza Taq- izolowana z bakterii termofilnych (Thermus
aquaticus). Opt działania 72ºC (stabilna w 94ºC), technika PCR
4)
Polimeraza DNA I- synteza nici DNA komplementarna do matrycy DNA
(m.in. fragment Klenow pozbawiony aktywności egzonukleazy 5’-3’
5)
RNaza A- nukleaza, degraduje RNA nie naruszając DNA
6)
RNaza H- nukleaz, trawi nici RNA w strukturach hybrydowych RNA-DNA
7)
Polimerazy RNA- np. T3, T7, SP6, bakteriofagowe o określonej
specyfice, synteza nici RNA, wykorzystywane do transkrypcji
fragmentów DNA
8)
Ligaza T4 DNA- łączy dwuniciowe fragmenty DNA o końcach tępych
lub lepkich (kohezyjnych)
9)
Kinaza polinukleotydowa- przenosi reszty P na koniec 5’ jedno i
dwuniciowych DNA/RNA
10)
Fosfataza alkaliczna- usuwa reszty P z końców 5’ DNA/RNA,
podobnie jak kinaza wykorzystywana m.in. do tworzenia sond
molekularnych
11)
Exonukleaza lambda- 5’-3’ egzodeoksyrybonukleaza, selektywnie
trawi 5’ fosforyzowany łańcuch dwuniciowego DNA
Niemal
wszystkie enzymy stosowane w IG wsytępuja w licznych wersjach, każda
swoiste cechy i wynikający z nich zakres zastosowan (ang. Features,
applications)- opis producenta.
Termofilne
polimerazy DNA
Bogata
oferta enzymów tej grupy (liczne białka rekombinowane).
Każdy
ma specyficzne cechy (np. brak/ obecność właściwości
egzonukleazy 3’-5’, 5’-3’, odmienna skala tych aktywności) i
one decydują o preferencjach wykorzystania enzymów w okreś
sytuacjach (np. w reakcjach sekwencjonowania DNA, PCR wysokiej
specyficzności, real-time PCR, RT-PCR, znakowanie DNA). Optimum
aktywności 70-72 ºC (aktywne w 95 ºC).
Inaktywacja:
ekstrakcja mieszaniną fenol/ chloroform.
Aktywność
komercyjna 1-10U/µl
Taq
polymerase- z Thermus
aquaticus, synteza ds dupleksów w kierunku 5’-3’, preferowana w
amplifikacjach bakteryjnych sekwencji DNA, generuje produkty PCR
przeznaczone do klonowania w mscach AT
Pfu
polymerase- z
Pyrococcus furiosus kuz tzw rekombinowana z E.coli ze sklonowanym
genem Pol z P.furiosu. Wysoka precyzja syntezy. Generuje produkty PCR
o tępych końcach.
DreamTag
DNA polymerase-
zmodyfikowana Tag polimeraza generuje produkty PCR z tzw ogonami Da
na 3’ końcach (stwarza możliwość klonowania ich w liniowanym
wektorze kloningowym zawierającym oligo-dT na 5’ końcu (np.
wektor pGEM)
Mezofilne
polimerazy DNA
Izolowane
z drobn zdolnych do wzrostu w temp umiarkowanych.
Optymalna
temp wzrostu zależna od gatunku 20-37
Grupa
enzymów, w tym: DNA polymerase I E.coli; Klenov fragment, T4 DNA
polymerase, T7polymerase, terminal transferase, phi29 DNA polymerase.
Zależnie
od cech wykorzystywana do: znakowania końców DNA, sewkencjonowania,
generowania tępych końców, ukierunkowanej mutagenezy,
dobudowywania nukleotydów na końcu 5’.
Aktywność
enzymów 1-10U/µl.
Wszystkie
inaktywowane przez ogrzanie 65-75ºC/10’.
Większość
to rekombinowane białka- geny sklonowano w komórkach E.coli (np. T4
DNA Pol z wklonowanym genem bakteriofaga T4 czy TT- z genem TT z
grasicy cielęcej i wstawionym w w genom E.coli.
Artykuły powiązane:
19 Paź 2013 ... Tu dochodzimy do jednej z cech kodu genetycznego - degeneracji kodu DNA. Jeden aminokwas .... Jest to majstersztyk inżynierii genetycznej.
|
29 Mar 2013 ... Historia inżynierii genetycznej w pigułce. Historia: 1950- Chargaff – zdefiniowanie relacji między 4 nukleotydani w DNA. 1951 – Mc Clintoch ...
bio-strefa.blogspot.com
Świetny artykuł :)
OdpowiedzUsuń