piątek, 1 lipca 2016

Enzymy jako narzędzia inżynierii genetycznej

enzymy restrykcyjneNarzędzia inżynierii genetycznej - enzymy

Enzymy restrykcyjne (restryktazy)- endonukleazy bakteryjne.
Hydroliza DNA przy ich użyciu to pkt wyjścia do innych technik IG.
Powstałe frakcje DNA to substraty dla dalszych analiz, mają identyczne zakończenia (nie są losowe).
Rozpoznają tzw sekwencje palindromowe w większości odmienne.
Wyjątki: izoschizomery.
Nazewnictwo:
  • Pierwsza litera - rodzaj bakterii
  • Druga i trzecia - gatunek
  • Następna - szczep lub typ
  • Kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują cyfry rzymskie (np. EcoRI, EcoRII, EcoRV)
Jednostka enzymu- to jego ilość, która kompletnie hydrolizuje 1µg DNA faga λ (około 50kb) w czasie 1h w temp 37ºC. Istotne proporcje DNA: enzym w ustalaniu parametrów reakcji enzymatycznej (star activity)!!! Np. nadmiar enzymu może powodować, że pojawiają się dodatkowe aktywności oprócz tych, które są przypisane danemu enzymowi. Poza fragmentami określonymi, mogą się pojawiać jakieś dodatkowe.

Izoschizomery
Istnieją enzymy takie które je posiadają i takie, które nie posiadają.
Izolowane z różnych organizmów, rozpoznają takie same motywy sekwencyjne (np. niektóre pary I. różnią się wrażliwością na metylację C, A np. HpaII-Msp czy MboI-Sau3A)
Niekiedy enzymy generują identyczne wystające końce (kompatybilne), mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA (np. BamHI- G/GATCC i MboI- /GATC)
Restryktazy rozpoznające bardziej złożone motywy (8 nukleotydów) np. AsiSI, AscI, SwaI, SbfI wykorzystywane w analizach całkowitych, genomowych DNA, gł pozyskiwanych z org Eucaryota

Ważne jest, aby wiedzieć czy dany enzym generuje tępe, czy lepkie końce:
Tępe końce (płaskie)- 2 nici cięte w sposób symetryczny
Wystające końce (lepkie)- brak symetrii cięcia w komplementarnych niciach

Nie zawsze sekwencja rozpoznawana przez enzym jest precyzyjnie określona co do 1 nukleotydu

Enzymy rzadko tnące- generują mniej fragmentów

Rozpoznawane 4 nukleotydy- smuga spowodowana nakładaniem się na siebie dużej ilości fragmentów
6 nukleotydów- wyżej
8 nukleotydów- jeszcze wyżej

Enzymy restrykcyjne stwarzają możliwość konstrukcji map fizycznych DNA (hydroliza wieloma enzymami), na podstawie analizy rozdziału elektroforetycznego produktów reakcji hydrolizy
Użyteczne w diagnostyce molekularnej m.in. dzięki nim wykrywane są mutacje odpowiedzialne za występowanie chorób (Southern, RFLP).

EcoRI- charakterystyka enzymu:
  • Źródło: E.coli
  • Wrażliwość na metylację: metylacja dam i dcm brak wrażliwości, sekwencja rozpoznawana przez ten ezn nie jest metylowana
  • Inaktywacja enzymu: 65ºC przez 20min
  • Ligacja
Przygotowanie i łączenie fragmentów DNA
1) Tworzenie i łączenie lepkich (wystających) końców z wykorzystaniem jednego enzymu (DNA z dwóch różnych źródeł)
Inaktywacja DNA (po inaktywacji restryktaz!!!)
2) Hydroliza różnymi restryktazami, tworzenie komplementarnych końców (lepkich) i ich łączenie (na przykładzie BamHI, BglII, BclI, Sau3A). Dna z jednego lub innych źródeł.
Ligaza DNA
3) Formowanie tępych (płaskich) końców przez wypełnianie lepkich końców powstałych po hydrolizie enzymami, które nie tworzą końców wobec siebie komplementarnych (np. HindIII, EcoRI, BamHI).
Polimeraza DNA, dNTP, ligaza DNA + ATP (po inaktywacji restryktaz)
4) Tworzenie i łączenie płaskich końców w wykorzystaniem różnych restryktaz (np. HaeIII, SmaI, AluI)
Ligaza DNA + ATP (duży nakład)
5) Tworzenie komplementarnych lepkich końców poprzez częściowe wypełnianie końców
SalI
Polimeraza, dTTP, DTP

Bam HI
Polimeraza, dATP, Stp.

Ligaza DNA
6) Łączenie lepkich końców za pomocą syntetycznych adapterów
EcoRI
Adapter
BamHI
Ligaza DNA
Istnieje możliwość wprowadzania pożądanych miejsc restrykcyjnych do początku i końca sekwencji kodujących genu, co pozwala w kolejnych etapie na ściśle określoną inercję genu w odpowiednio przygotowany wektor.

Do inaktywacji zamiast 65ºC wykorzystuje się czasem fenol

Efektywność hydrolizy DNA
Szybkość i kompletność hydrolizy związana jest z:
  • Czystością preparatu
  • Poziomem jego metylacji (hamuje reakcję)
  • Doborem warunków trawienia (bufor, proporcje DNA: enzym)
Liczne szczepy, z których izoluje się plazmidy zawierają specyficzne metylazy (dam- metyluje A w obszarze GATC i dcm metyluje wewnętrzną C w CC(A/T)GG).
Inhibują one działanie licznych enzymów.
Plazmidowy DNA izolowany z takich szczepów może być oporny na hydrolizę.
Lepiej transformować, a później izolować plazmidy ze szczepów dam- czy dcm-.
Eukariotyczne DNA zawiera pewien % 5mC (szczególnie u roślin, istotne różnice na poziomie tkanek).

Ilość DNA przeznaczona do analiz restrykcyjnych 0,2-2µg dla Prokaryota i 5-10µg dla Eukaryota.
W I przypadku w wyniku hydrolizy powstają nieliczne, zdefiniowane fragmenty.
W II- charakterystyczne smugi DNA z pasmami frakcji repetytywnych na ich tle (po elektroforezie)

Alternatywne (mechaniczne) metody fragmentacji DNA
Shearing przy użyciu strzykawki z igłą.
Stopień fragmentacji zależy od grubości igły i ilości przypuszczeń.
Uzyskuje się fragmenty zakończone tępo (nici DNA pękają zwykle naprzeciwko siebie).
Różnorodność powstałych fragmentów jest bardzo duża, pęknięcie może nastąpić w dowolnym mscu.

Sonikacja- preparat DNA poddawany działaniu ultradźwięków. Powodują one pękanie nici. Odpowiedni stopień fragmentacji można uzyskać dobierając eksperymentalnie warunki sonikacji (czas, natężenie impulsu, liczba impulsów).

Podstawowe enzymy w technikach IG- modyfikujące DNA/RNA:
1) Odwrotna transkryptaza- polimerazy DNA zależne od RNA.
Synteza nici DNA komplementarnej do matrycy RNA w kierunku 5’-3’, wymagają startera z wolną gr 3’-OH i dNTP, zaleznie od rodzaju, opt działania w 37-50
2) Terminalna transferaza- dodaje kilka nukleotydów do końca 3’ DNA/RNA
3) DNA polimeraza Taq- izolowana z bakterii termofilnych (Thermus aquaticus). Opt działania 72ºC (stabilna w 94ºC), technika PCR
4) Polimeraza DNA I- synteza nici DNA komplementarna do matrycy DNA (m.in. fragment Klenow pozbawiony aktywności egzonukleazy 5’-3’
5) RNaza A- nukleaza, degraduje RNA nie naruszając DNA
6) RNaza H- nukleaz, trawi nici RNA w strukturach hybrydowych RNA-DNA
7) Polimerazy RNA- np. T3, T7, SP6, bakteriofagowe o określonej specyfice, synteza nici RNA, wykorzystywane do transkrypcji fragmentów DNA
8) Ligaza T4 DNA- łączy dwuniciowe fragmenty DNA o końcach tępych lub lepkich (kohezyjnych)
9) Kinaza polinukleotydowa- przenosi reszty P na koniec 5’ jedno i dwuniciowych DNA/RNA

10) Fosfataza alkaliczna- usuwa reszty P z końców 5’ DNA/RNA, podobnie jak kinaza wykorzystywana m.in. do tworzenia sond molekularnych
11) Exonukleaza lambda- 5’-3’ egzodeoksyrybonukleaza, selektywnie trawi 5’ fosforyzowany łańcuch dwuniciowego DNA

Niemal wszystkie enzymy stosowane w IG wsytępuja w licznych wersjach, każda swoiste cechy i wynikający z nich zakres zastosowan (ang. Features, applications)- opis producenta.

Termofilne polimerazy DNA
Bogata oferta enzymów tej grupy (liczne białka rekombinowane).
Każdy ma specyficzne cechy (np. brak/ obecność właściwości egzonukleazy 3’-5’, 5’-3’, odmienna skala tych aktywności) i one decydują o preferencjach wykorzystania enzymów w okreś sytuacjach (np. w reakcjach sekwencjonowania DNA, PCR wysokiej specyficzności, real-time PCR, RT-PCR, znakowanie DNA). Optimum aktywności 70-72 ºC (aktywne w 95 ºC).
Inaktywacja: ekstrakcja mieszaniną fenol/ chloroform.
Aktywność komercyjna 1-10U/µl

Taq polymerase- z Thermus aquaticus, synteza ds dupleksów w kierunku 5’-3’, preferowana w amplifikacjach bakteryjnych sekwencji DNA, generuje produkty PCR przeznaczone do klonowania w mscach AT

Pfu polymerase- z Pyrococcus furiosus kuz tzw rekombinowana z E.coli ze sklonowanym genem Pol z P.furiosu. Wysoka precyzja syntezy. Generuje produkty PCR o tępych końcach.

DreamTag DNA polymerase- zmodyfikowana Tag polimeraza generuje produkty PCR z tzw ogonami Da na 3’ końcach (stwarza możliwość klonowania ich w liniowanym wektorze kloningowym zawierającym oligo-dT na 5’ końcu (np. wektor pGEM)

Mezofilne polimerazy DNA
Izolowane z drobn zdolnych do wzrostu w temp umiarkowanych.
Optymalna temp wzrostu zależna od gatunku 20-37
Grupa enzymów, w tym: DNA polymerase I E.coli; Klenov fragment, T4 DNA polymerase, T7polymerase, terminal transferase, phi29 DNA polymerase.

Zależnie od cech wykorzystywana do: znakowania końców DNA, sewkencjonowania, generowania tępych końców, ukierunkowanej mutagenezy, dobudowywania nukleotydów na końcu 5’.
Aktywność enzymów 1-10U/µl.
Wszystkie inaktywowane przez ogrzanie 65-75ºC/10’.
Większość to rekombinowane białka- geny sklonowano w komórkach E.coli (np. T4 DNA Pol z wklonowanym genem bakteriofaga T4 czy TT- z genem TT z grasicy cielęcej i wstawionym w w genom E.coli.

Artykuły powiązane:
19 Paź 2013 ... Tu dochodzimy do jednej z cech kodu genetycznego - degeneracji kodu DNA. Jeden aminokwas .... Jest to majstersztyk inżynierii genetycznej.
29 Mar 2013 ... Historia inżynierii genetycznej w pigułce. Historia: 1950- Chargaff – zdefiniowanie relacji między 4 nukleotydani w DNA. 1951 – Mc Clintoch ...
bio-strefa.blogspot.com

Brak komentarzy:

Prześlij komentarz

Zapraszamy do komentowania, każdą uwagą warto się podzielić

Related Posts Plugin for WordPress, Blogger...