
Kolonie Escherichia coli (Pałeczka okrężnicy) na szalce
Było to możliwe, ponieważ ten sam kod genetyczny jest
podstawą całego życia na planecie. Kod składa się z 4 liter (nukleotydów),
które tworzą rdzeń łańcucha DNA: A (adeniny),C (cytozyny),G (guaniny) i T (tyminy).
Trzy "litery" tworzą kodon (triplet), kodujący jeden z aminokwasów, elementów
składowych białek. Na przykład GCA koduje alaninę, TGT - cysteinę. Łańcuch
nukleotydów przepisywany jest łańcuch aminokwasów, do momentu napotkania na
kodon "STOP", oznaczający triplet przerywający pracę sunącej po nici mRNA maszynerii produkującej
białko i oznaczający zakończenie podstawowego etapu produkcji
białka.
Kod jest taki sam dla każdego genu na planecie. U ludzi, roślin
czy bakterii te same kodony odpowiadają tym samym aminokwasom (z drobnymi
różnicami na przykład przy kodonach typu START u bakterii i archeonów). Kod
zawiera jednocześnie wiele redundacji. "Litery" DNA mogą ułożyć się w 64
różne triplety, a mamy tylko 20 aminokwasów, kodony STOP i START. Tu dochodzimy
do jednej z cech kodu genetycznego - degeneracji kodu DNA. Jeden aminokwas może być przez
wiele kodonów (tripletów). Na przykład GCT, GCA, GCC i GCG kodują alaninę. Ta zmienność
daje pole popisu do popisu dla genetyków, bo czasami zastosowanie określonego
kodonu pociąga za sobą pewne skutki...
Zespoły z Harvardu i Yale, kierowane przez Farrena Isaaca i
Georga Churcha podmieniły kodony TAG na TAA w całym genomie bakterii E. Coli,
powszechnie występującej w środowisku i będącej jednocześnie podstawowym mikrobem ("królikiem") doświadczalnym. Obydwa
kodony oznaczają "STOP", więc dla bakterii teoretycznie nie ma żadnej różnicy. To tak jakby
podmienić drogowy znak "stop" na taki sam, ale innej firmy ;). Ale nie to było
celem - niewykorzystany, podmieniony kodon TAG zostanie wykorzystany do zakodowania innego
aminokwasu, spoza standardowej 20. Otwiera to nową drogę dla wielu zastosowań Stworzony organizm został nazwany GRO - genomically recoded organism.
Na razie zespół proponuje 3 zastosowania. Po pierwsze,
dzięki przypisaniu kodonu do nowych aminokwasów, można produkować więcej
białek, także tych nie wytwarzanych normalnie przez żywe organizmy. Można to
wykorzystać do produkcji nowych typów leków czy materiałów, od polimerów dostarczających
leki w określone miejsca w organizmie po powierzchnie antybakteryjne. Nowy
aminokwas daje chemikom i inżynierom więcej opcji do osiągnięcia swoich celów.
Rekodowane organizmy mogą być więc
wykorzystane jako fabryki do produkcji materiałów o nowych i ekscytujących właściwościach
- mówi Isaak.
Po drugie można użyć poprawiony kod genetyczny do stworzenia
organizmów odpornych na wirusy. Ma to duże znaczenie dla przemysłu; dla
przykładu firma biotechnologiczna GENZYME musiała zamknąć swój zakład na wiele
miesięcy po skażeniu przez wirus, co spowodowało milionowe straty (wirus zaatakował
hodowle komórkowe wykorzystywane do produkcji). Wirusy "rozmnażają się" przez
przejęcie komórki ofiary i wykorzystują jej maszynerię do produkcji białek
(niektórzy nawet porównują same wirusy do zarodników, a właściwą formą życia ma
być przejęta przez wirus komórka).
Wirusy są więc zależne - ich białka własne muszą być kodowane przez te same
triplety, które wykorzystuje komórka-ofiara. Jeżeli gospodarz będzie korzystał
z innego kodowania, to instrukcje wirusa staną się bezużyteczne - komórka
będzie produkować zmienione, bezużyteczne dla niego białka.
Zespół potwierdził, że zmienione mikroby są mniej podatne na
przynajmniej jeden typ faga - typu wirusa atakującego bakterie. Co prawda nie
były niepokonane, ale kolonie mogły dłużej przetrwać. Efekt był niewielki, ale
zauważany. Kodon TAG jest rzadki (dlatego wzięto go na warsztat - mniej pracy przy podmienianu), występuje tylko na końcach genu. Ale przecież zarówno TAA jak
i zamieniany TAA znajdują się w "słowniku" wirusa. Teoretycznie przed i po
podmianie nie powinno być żadnych efektów. Jednak ich wystąpienie sugeruje, że kodujące teoretycznie to samo kodony dają inne właściwości. Większe zmiany mogą więc prowadzić
do pełnej ochrony przed wirusami.
Po trzecie, zmieniony kod może być wykorzystywany
przez organizmy modyfikowane genetycznie, chroniąc je przez krzyżowaniem się z "naturalnymi". To genetyczna wersja przypowieści o Wieży Babel - organizmy
modyfikowane staną się więźniami własnych zmian, nie będą mogły wymieniać genów
z naturalnymi odpowiednikami. Będą "mówiły" innym kodem.
Rekodowanie opiera sie na dwóch technologiach opracowanych
przez zespół - MAGE, podmieniającej TAG na TAA w pociętych fragmentach genomu
bakterii, oraz technologii CAGE, która poskładała pocięte i wyedytowane fragmenty w
jeden genom nowego szczepu bakterii.
MAGE debiutowała dwa lata temu. Oznacza “multiplex automated
genome engineering” i pozwala łatwo i szybko dokonywać wielu zmian w genach na
masowa skalę. Pierwotnie była wykorzystywana do tworzenia milionów wariantów genomów
bakteryjnych, które mogły być testowane pod
kątem przydatności dla człowieka. Dlatego nazwano ją "maszyną ewolucyjną". W
ciągu kilku dni maszyna wyewoluowała bakterię E. coli zdolną do produkcji dużych
ilości likopenu, czerwonego i bardzo zdrowego barwnika pomidorów.
MAGE, genetyczna maszyna ewolucyjna
MAGE jest jednak wszechstronnym edytorem. Może nie tylko
tworzyć wiele zróżnicowanych zmian w grupach komórek, ale też kreować
specyficzne zmiany w pojedynczej komórce. I właśnie do tego wykorzystał ją tym
razem zespół badawczy. Kodon TAG występuje w 321 miejscach genomu E.coli. Dla
każdego miejsca zespół wytworzył mały fragment DNA, w którym TAG było
zastąpione TAA (reszta pozostała bez zmian). Te fragmenty zostały przez maszynę "wklejone" losowo do bakterii, na mechanizmy ewolucyjne wybierały te, które u których wklejenie się powodło. Rezultat: bakteria z częściowo wyedytowanym
genomem.
Tą drogą wyprodukowano 31 szczepów, różniących się
podstawieniami TAA pod TAG w różnych miejscach. Może wydaje się to nadmiernie
skomplikowane, jednak podmiana w jednym kroku byłaby nieefektywna, powolna i z
wieloma błędami. Jeden błąd zniszczyłby cały projekt. Metodą małych kroków
zespół mógł ominąć ten problem.
Aby połączyć 32 szczepy bakterii z częściową edycją w jeden
z pełną, zespół opracował technologię CAGE (conjugative assembly genome
engineering). Wykorzystuje koniugację bakterii, procesu podczas którego dwie
bakterie łączą się i wymieniają materiałem genetycznym (taki substytut dla rozmnażania
płciowego).
Poszczególne szczepy bakterii łączono w pary, tak aby każda
strona dostarczyła swoją wersję zmian. 32 szczepy z 10 zmianami utworzyło 16
szczepów z 20 zmianami. I tak z 16 zrobiono, 8 a z 8 - 4 szczepy. Do koniugacyjnych
półfinałów stawiły 4 szczepy E.coli, a każdy z nich posiadał 1/4 genomu z
podmienionymi kodonami TAG. W finałach utworzyły one pojedynczy szczep, który
posiadał jedynie kodony podmienione na TAA. Pozbyto się także czynnika RF1,
białka rozpoznającego kodon TAG jako kodon STOP i wstrzymującego produkcję (pod
ten kodon będzie można przypisać inną funkcję).
W uzyskanej bakterii wykryto 355 mutacji i namnażała się ona
w normalnym tempie. Jej genom był wolny od TAG w swojej pierwotnej funkcji.
Zespół będzie mógł więc przypisać do niego nowy aminokwas, a Isaac porównał to do
metody "plug and play", ale z podpięciem nowej cząsteczki. Po tym przetestowano
odporność bakterii na wirusy. Nie były co prawda całkowicie odporne, jednak do
uzyskania takiego efektu trzeba podmienić wszystkie rodzaje kodonów STOP.
Co w przyszłości? Teraz zespół skupia się na "przegraniu" antysensownego kodonu TAG na sensowny, kodujący aminokwas. Jest to o wiele
trudniejsze, niż to, co zrobiono wcześniej. Zanim dokona się takiej zmiany, trzeba
rozwikłać zagadkę włączania i wyłączania określonych genów, funkcji białek
przez nie kodowanych, efektywności oraz regulacji ich produkcji i wielu innych rzeczy. A ponieważ geny bakteryjne nakładają się na
siebie, zmiana w jednym kodonie pociągnie za sobą zmiany w wielu genach. Według
współautora Marca Lajoie, to nie jest koniec listy. Trzeba brać pod uwagę mechanizmy i zjawiska, o których jeszcze nie wiemy.
Co więcej kodony sensowne (kodujące aminokwasy), występują o
wiele częściej niż kodony STOP. E.coli ma 321 miejsc w których jest TAG.
Dodając do tego następne w kolejce najrzadsze kodony - AGA i AGG, mamy ponad 5 000
zmian do wykonania. Jeżeli chcesz podmienić 13 tych najrzadszych (zespół
określa je jako “forbidden codons”), trzeba zrobić 150 000 zmian... Bez pełnej
automatyzacji raczej sie nie obejdzie.
Aby sprawdzić wykonalność takiego założenia i jakie
przyniesie to skutki dla bakterii, Lajoie i Siriam Kosuri próbowali rekodować "zakazane kodony", podmieniając je na zamienniki kodujące inny aminokwas.
Zamiast działać na całym genomie E.coli (co zrobił poprzedni zespół), skupili się
na 42 najważniejszych genach bakterii. Dzięki temu mieli do wykonania tylko 405
zmian zamiast 155 000.
Podmiana TAG w całym genomie to pierwszy krok i zakończył
się on powodzeniem. W naszym badaniu w praktyce oczekiwaliśmy na porażkę - mówi
Lajoie. Dzięki temu można zobaczyć, co może działać, a co nie i oszczędzić
rozczarowań w przyszłości.
Wykazano, że 26 z 42 rekodowanych genów można wykorzystać -
bakterie w tych przypadkach były zdolne do przeżycia, wzrastały średnio 20%
wolniej niż normalne. Co ważne, każda z 405 zmian w 26 genach może być
rekodowana indywidualnie, jak i w grupach. Wszystkie "zakazane kodony" można
podmienić.
Było to zaskakujące i bardzo zachęcające - mówi Lajoie.
Oznacza to, że wszystkie z nich są podatne na usuwanie. Sukces czy porażkę
będzie determinować specyficzność określonego genu, i to, czy będziemy w stanie
sobie z tym poradzić.
Zachęcony wynikami zespół rozpoczął podmianę kodonów
sensownych w całym genomie E.coli. To pozwoli zmienić ich technologię z
technologicznego dema na praktyczne zastosowanie. Pozwoli to także zgłębić
naturę naszego kodu genetycznego. W jaki sposób ewoluował, dlaczego posiada strukturę
tripletową, z trzema literami nukleotydów? Do jakiego stopnia jest plastyczny? Jedynym sposobem, aby się przekonać, jest dokonanie fundamentalnych zmian i
obserwowanie ich wyników - mówi Isaac. Dopiero zaczęliśmy dostrzegać sieć zależności,
które leżą u podstaw funkcjonowania genomu. Nikt nie rozumie całej jego złożoności
- dlatego jest to takie trudne - dodaje Lajoie.
Jest to majstersztyk inżynierii genetycznej. Wykazano, że nie
ma podstawowych barier dla rearanżacji kodonów. Jest to ćwiczenie w przezwyciężaniu
małych przeszkód, a za każdą kryje sie technologia do opracowania - komentuje
Chang Liu, bioinżynier z University of
California.
PODOBAŁO SIĘ? CHCESZ BYĆ NA BIEŻĄCO Z KOLEJNYMI ARTYKUŁAMI?
Tłumaczenie i opracowanie na podstawie phenomena.nationalgeographic.com,
mgr Seweryn Frasiński
Genomically Recoded Organisms Expand Biological Functions. dx.doi.org/10.1126/science.1241459
Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential
Genes. dx.doi.org/10.1126/science.1241460
Komentarze
Prześlij komentarz
Zapraszamy do komentowania, każdą uwagą warto się podzielić